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怎样选择用于筛选酵母单杂交文库的DNA结合靶序列?
发布日期:2015-04-03   分类:

为了达到实验的预期效果,在进行酵母单杂交文库筛选实验之前,首先需要确定作为筛选诱饵的DNA结合靶序列。

一般用作靶结合序列的长度通常只有5-7bp,如果为了增强与蛋白质结合的效率,可以重复2-3个拷贝,总长度约在20 bp左右比较合适。这样筛选到的结合蛋白就特异性比较强。

      如果不事先确定靶结合序列,而随意选用较长的一段序列作为诱饵筛选的话,因为其中可能包括多个不同种类的靶结合序列,最终筛选到的结合蛋白就会比较混杂,专一性不强,势必增加后续研究的复杂性。

一般有三种常用的方法可以有助于研究者做出这样的选择:

1. 参考前人发表的研究论文。如果前人的研究论文中已经报道过某个DNA序列是某种蛋白结合的靶序列,并且该论文已经被后人的实验所证实过,那么这样的结果就是比较可靠的。

2. 参考自己以往的实验结果。如果研究者已经对某个基因的转录调控区或启动子片段做过系列缺失或点突变发现了其中某段序列对于该基因的转录具有重要作用。或者研究者已做过ChIP的检测发现了某个蛋白结合的一段DNA序列。则可选择该序列,而不必用整个启动子或转录调控区做酵母单杂交。

   3. 参考生物信息学分析的结果现在有不少专门用于分析和预测启动子结构特征的网址(见附),可把您感兴趣的一段或整个基因转录调控区的序列找精通生物信息学专业的人帮您分析。当然也可以自学摸索需要一个逐渐熟悉的过程。

      需要指出的是,因为生物的多样性和复杂性,而且与蛋白结合的DNA序列通常只有几个碱基,即使启动子序列中存在预测的结合位点,也未必就是真正的结合位点。目前无论多好的分析软件预测的结果最多只有70%左右的准确率,一般只有30-50%的准确率。所以生物信息学预测的结果,并不一定就是准确的,只能作为一种参考最终还要以实验的结果为准。

   

附录:分析和预测启动子结构的常用网址

http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/

国际基因组数据库

美国国际生物技术信息中心:www.ncbi.nlm.nih.gov

欧洲生物信息学研究所:www.ebi.ac.uk/embl

日本国家遗传学研究所:www.ddbj.nig.ac.jp

植物数据库:PlantCARE  http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/

植物数据库:PLACE

http://bip.weizmann.ac.il/toolbox/seq_analysis/promoters.html#databases
http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html
http://sdmc.lit.org.sg/promoter/CGrich1_0/CGRICH.htm
http://www.gene-regulation.com/pub/programs.html#pmatch
http://ihome.cuhk.edu.hk/~b400559/arraysoft_pathway.html#Promoter
http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html
http://intra.psb.ugent.be:8080/PlantCARE/
http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/
http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/proscan/
http://thr.cit.nih.gov/molbio/signal/
http://molbiol-tools.ca/Promoters.htm
http://bioportal.bic.nus.edu.sg/tres/