联系我们

上海龙旸生物科技有限公司

上海龙旸生物科技有限公司

联系人:张先生

电 话:18516259818

传 真:

手 机:13918484428

网 址:http://www.Sh-longyang.com

地 址:上海市杨浦区邯郸路100弄61号楼179室

邮 编:200433

邮 箱: 1658586137@qq.com longyangbiotech@163.com


公司资讯

酵母双杂交系统操作方法

发布日期:2022-04-03

一、LexA酵母双杂交系统的设计原理

报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除,因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下,报告基因LacZ的转录活性为零,该基因的筛选标志为URA3,可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中,也可以被整合到EGY48基因组DNA上。 质粒pLexA的筛选标志为HIS3,在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵,Bait)的融合蛋白,该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控,选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。

质粒pB42AD的筛选标志为TRP1,在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游,含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于E.coli的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列,共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。

在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu,它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA,但两者启动子不同。

根据双杂交系统的原理,如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性,即可激活报告基因的转录和表达。分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中,然后共同转入含有报告基因的酵母菌株,如果蛋白X与Y能相互作用,则启动报告基因的转录和表达,通过检测报告基因的表达情况,就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。

如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库,则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白,并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。  

二、商品化酵母双杂交系统的组成

1. 载体质粒:pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库

2. 酵母菌株:EGY48、EGY48(p8op-LacZ)、YM4271(EGY48的伴侣菌株) 3. 大肠杆菌菌株:E.coli KC8株 4. 对照质粒:  

质 粒   用 途

pLexA-53,pB42AD-T 阳性对照

pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD融合蛋白〕 阳性对照

pLexA-Lam(LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用) 假阳性检测质粒 5. 引物:

pLexA测序引物及pB42AD测序引物。  

三、酵母双杂交实验的基本流程

1. 将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株,用培养基SD/-Ura筛选。 2. 同时构建或扩增DNA文库,并纯化足够的质粒以转化酵母细胞。 3. 构建DNA-BD/靶蛋白质粒pLexA-X,作为钓饵(bait)。

4. 将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48(p8op-LacZ)细胞株,用SD/-His/-Ura筛选;并用固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Ura检测此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活报告基因的活性,以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性。  

转化质粒 选择培养基 克隆生长情况 说 明 (含有Gal/Raf)    

pLexA-Pos SD/-His,-Ura 蓝 阳性对照 pLexA SD/-His,-Ura 白 阴性对照

PlexA-X SD/-His,-Ura 白 没有直接激活活性 PlexA-X SD/-His,-Ura 蓝 具有直接激活活性

PlexA-X SD/-His,-Ura 菌落不能生长 酵母细胞毒性  

4-1. 如果pLexA-X -半乳糖苷酶的信号作用。能够自动激活报告基因,则设法去除其激活活性部位、或者将LacZ报告基因整合入基因组,减少

4-2. 如果pLexA-X虽然不会自动激活报告基因,但对酵母宿主细胞有毒性,则需要与纯化的文库DNA同时转化酵母